Редактирование: Опиатные рецепторы

{{Клинфарм1}}
== Опиатные рецепторы ==

Основные типы опиатных рецепторов — μ, δ и к — изучены уже достаточно подробно. Широкие перспективы открыло обнаружение близкого к ним рецептора, ORL1 (opioid-receptor-like 1). В начале 1980-х гг. удалось получить избирательные лиганды основных опиатных рецепторов (в частности, DAMGO для μ-, DPDPE для δ- и U-50488 и U-69593 для к-рецепторов; Handa et al., 1981; Mosberg et al., 1983; Voightlander et al., 1983). Это позволило охарактеризовать особенности связывания рецепторов с лигандами, а также их локализацию (с помощью радиоавтографии). Опиатные рецепторы по-разному распределены в головном и спинном мозге и в периферических тканях (Mansour etal., 1988; Neal etal., 1999b). На основе локализации опиатных рецепторов были сделаны предположения об их функциях, в дальнейшем изученных в экспериментах in vitro и in vivo.
[[Image:Gud_tab_23_2.jpg|300px|thumb|right|Таблица 23.2. Опиатные рецепторы и их функции]]

Получение избирательных стимуляторов и блокаторов опиатных рецепторов облегчило изучение их функций in vivo. В качестве блокаторов обычно используют циклические аналоги соматостатина, в частности СТОР (для μ-рецепторов), производное налоксона налтриндол (для δ-рецепторов) и производное налтрексона норбиналторфимин (для к-рецепторов; Gulya et al., 1986; Portogheseet al., 1987; Portoghese et al., 1988). В целом, эти работы выявили значительное сходство между μ- и δ-рецепторами и резкие различия между ними и к-рецепторами. Путем введения животным избирательных блокаторов и стимуляторов опиатных рецепторов было установлено, с какими рецепторами связаны различные эффекты опиоидов (табл. 23.2).

Большинство наркотических анальгетиков по строению близки к морфину, благодаря чему они относительно избирательны в отношении μ-рецепторов (табл. 23.3 и 23.4). Заметим, что с повышением дозы (особенно при попытке преодоления толерантности) избирательность утрачивается и фармакологические свойства препарата могут меняться. Некоторые препараты, прежде всего агонисты-антагонисты, в обычных дозах действуют на несколько рецепторов и могут выступать стимуляторами одних и блокаторами других.
[[Image:Gud_tab_23_3.jpg|300px|thumb|right|Таблица 23.3. Действие опиоидов на различные опиатные рецепторы]]

Данные фармакологических исследований позволяют говорить о нескольких подтипах каждого из опиатных рецепторов, однако общепринятой классификации этих подтипов нет. Обширная литература указывает на существование по меньшей мере одного особого подтипа к-рецепторов, характеризующегося высоким сродством к производным бензоморфана (пентазоцину и его аналогам) (Akil and Watson, 1994). То же относится и к 5-рецепторам: исследования с использованием меченых лигандов говорят о наличии их подтипов (Negri et al., 1991), и изучение поведения животных позволило выделить δ1 и δ2-рецепторы (Jiang et al., 1991; Sofuoglu et al., 1991). Подобным же образом были описаны μ1 и μ2-рецепторы' (Pasternak, 1986). Предполагалось, что μ-рецептор имеет очень высокое сродство к опиоидам и примерно одинаково связывает лиганды μ- и δ-рецепторов. Альтернативная гипотеза предполагает существование рецепторного высокоаффинного комплекса μ/δ, отрицая наличие отдельных μ-рецепторов (Rothman et al., 1988). Пока не удалось клонировать гены, кодирующие различные подтипы опиатных рецепторов; с другой стороны, последние работы указывают на изменение избирательности к лигандам за счет образования гетеродимеров опиатных рецепторов, что может объяснять разнообразие фармакологических эффектов опиоидов (см. ниже; Jordan and Devi, 1999).

== Молекулярная биология опиатных рецепторов ==

Долгие годы работы, посвященные разнообразию опиатных рецепторов, основывались на широком спектре природных и синтетических лигандов, однако гены этих рецепторов оставались неизученными. В 1992 г. удалось клонировать ген δ-рецепторп мыши (из клеточной линии NG-108; Evans et al., 1992; KiefTeret al., 1992). Вскоре были клонированы гены μ- и δ-рецепторов различных грызунов (Chen et al., 1993; Kong et al., 1994; Meng et al., 1993; Minami et al., 1993; Thompson et al., 1993; Wang et al., 1993; Yasuda et al., 1993). Поиск новых рецепторов привел к открытию рецептора ORL1. В дальнейшем были выделены последовательности ДНК, кодирующие опиатные рецепторы, и определена их локализация в хромосомах (Befort et al., 1994; Yasuda et al., 1994; Wang et al., 1994). Однако клонированный ген μ-рецептора кодировал единственный «классический» рецептор морфина. Не удалось выделить и подтипы δ-рецепторов: с синтезированным рецептором связывались все лиганды δ-рецепторов независимо от предполагавшейся (на основании поведенческих эффектов) избирательности в отношении δ1 и δ2-рецепторов. Гипотетический подтип к-рецепторов с высоким сродством к производным бензоморфана также не обнаружен. Все 4 опиатных рецептора близки построению (рис. 23.3) и относятся к суперсемейству [[Рецепторы, связанные с G-белками|рецепторов, сопряженных с G-белками]] (гл. 2). Рецептор ORL1 во многом гомологичен μ-, к- и δ-рецепторам, но его сродство к их лигандам очень низко или отсутствует (Bunzow etal., 1994; Chen etal., 1994; Mollereauetal., 1994). Дело в том, что сходство этих рецепторов ограничено в основном мембранными и цитоплазматическими доменами, тогда как внеклеточные домены, отвечающие за связывание с лигандами, существенно различаются (рис. 23.3, Б).

Возможно, в дальнейшем будут клонированы гены подтипов опиатных рецепторов. Однако разнообразие опиатных рецепторов и фармакологических эффектов наркотических анальгетиков может иметь два других объяснения: альтернативный сплайсинг РНК (с получением нескольких подтипов рецептора из одного гена) и образование гетеродимеров опиатных рецепторов.

Альтернативный сплайсинг (за счет пропуска экзонов или сохранения интронов) играет важную роль в образовании многих рецепторов, сопряженных с G-белками (Kilpatrick et al., 1999). Именно этот механизм может обеспечивать возникновение подтипов опиатных рецепторов. Для обнаружения возможных участков альтернативного сплайсинга широко используют антисмысловые олигонуклеотиды. Они связываются с определенными фрагментами кДНК, что позволяет изучить вклад отдельных экзонов в свойства рецептора. Выключение 1-го экзона из РНК μ-рецепторов мышей и крыс устраняет обезболивающий эффект морфина, а выключение 2-го экзона не влияет на действие морфина, но устраняет обезболивающий эффект героина, фентанила и морфин-6-глкжуронида, метаболита морфина (Rossi etal., 1995; Rossi etal., 1996a; Rossi etal., 1997). Антисмысловые олигонуклеотиды, комплементарные 3-му экзону, устраняют обезболивающий эффект морфин-6-глюкуронида, но не самого морфина (Rossi et al., 1997). Эти данные указывают на то, что в основе особенностей реагирования μ-рецепторов с различными опиоидами лежит именно альтернативный сплайсинг. Найдены также возможные участки альтернативного сплайсинга РНК к- и δ-рецепторов (Pasternak and Standifer, 1995). Однако решающее значение имеет выделение продуктов этого процесса in vivo. Так, обнаружен вариант μ-рецептора, существенно отличающийся от обычного μ-рецептора в области С-конца (Zimprich et al., 1995). Этот вариант (как и следовало ожидать, учитывая его строение) по спектру лигандов соответствовал μ-рецепторам, хотя и не подвергался свойственной им быстрой десенситизации под действием стимуляторов. Следовательно, наличием таких рецепторов нельзя объяснить описанные выше различия в обезболивающем действии разных опиоидов. Впрочем, сходный вариант рецептора, состоящий из транскриптов 2-го и 3-го экзонов, был обнаружен у мышей с выключенным 1 -м экзоном РНК μ-рецептора: морфин не вызывал у них обезболивания, тогда как эффект героина и морфин-6-глюкуронида сохранялся (Schuller et al., 1999).

Большое значение для функционирования рецепторов имеет образованием димеров. Например, рецептор ГАМКВ получается путем димеризации субъединиц ГAMKBRI и ГАМКBR2 (Jones et al, 1998). Показано, что к- и δ-рецепторы in vitro существуют в виде гомодимеров (Cvejic and Devi, 1997). Но особенно любопытны исследования, обнаружившие гетеродимеры опиатных рецепторов. С помощью иммунопреципитации удалось выявить гетеродимеры к- и δ-рецепторов как в культуре клеток, экспрессирующих эти рецепторы, так и в головном мозге (Jordan and Devi, 1999). Димеризация существенно меняет фармакологические свойства этих рецепторов. Сродство гетеродимеров к избирательным лигандам резко падает, а к стимуляторам с меньшей избирательностью (например, бремазоцину) — возрастает. Таким образом, образование гетеродимеров может по меньшей мере частично объяснять несоответствие молекулярных и фармакологических свойств опиатных рецепторов.

Таблица 23.4. Лиганды опиатных рецепторов

Рисунок 23.3. А. Гомология μ-, к-и 5-опиатных рецепторов. Б. Гомология рецептора 0RL1 и трех других опиатных рецепторов. Указана доля (%) идентичных аминокислот в данном домене. Akil etal., 1998.

Учитывая существование четырех семейств эндогенных опиоидов и четырех типов опиатных рецепторов, логично предположить соответствие между ними. Ранние исследования с использованием гомогенатов головного мозга не показали четкой связи между локализацией эндогенных опиоидов и теми или иными рецепторами. В целом, энкефалины имеют большее сродство к δ-, адинорфины — к к-рецепторам, но наблюдается и перекрестное взаимодействие (Mansour et al., 1995). Клонирование генов опиатных рецепторов позволило экспрессировать каждый из них по отдельности и затем сравнивать функции рецепторов в одинаковых условиях (Mansour et al., 1997). Наибольшей избирательностью обладают к-рецепторы (Kd составляет 0,1 нмоль/л для динорфина А, но уже около 100 нмоль/л для лей-энкефалина). Для μ- и δ-рецепторов Kd лигандов с наименьшим и наибольшим сродством отличаются лишь в 10 раз; большинство эндогенных опиоидов лучше связываются с 8-рецепторами. По-видимому, μ- и δ-рецепторы распознают в основном последовательность Тир—Гли—Гли—Фен, тогда как для связывания с к-рецепторами требуется также аргинин в 6-м положении (как у динорфина А и близких к нему пептидов, табл. 23.1). Энкефалины с аргинином в 6-м положении (например, мет-энкефалин—Apr—Фен и мет-энкефалин—Apr—Гли— Лей) также хорошо связываются с к-рецепторами, что противоречит гипотезе о соответствии опиатных рецепторов тем или иным эндогенным опиоидам. Таким образом, представители каждого семейства опиоидов могут иметь высокое сродство к любому из трех рецепторов (исключение составляет слабое взаимодействие эндорфинов с к-рецепторами), то есть хотя бы один пептид из каждого семейства имеет высокое сродство (IQ порядка 0,1—1 нмоль/л) к одному из них. Достаточно низкое сродство μ-рецепторов ко всем известным пептидам указывает на то, что избирательный лиганд еще предстоит обнаружить (см. ниже). 

'''Эндоморфины'''. Поиск пептидов с высоким сродством и избирательностью к ц-рецепторам привел к открытию новых эндогенных опиоидов — эндоморфина-1 и эндоморфина-2, тетрапептидов с последовательностью Тир—Про—Трп—Фен и Тир— Про—Фен—Фен (табл. 23.1; Zadinaet al., 1997). Несмотря на отсутствие опиоидного фрагмента (Тир—Гли—Гли—Фен), они имеют очень высокое сродство и избирательность к ц-рецепторам. Однако ген эндоморфинов пока не клонирован; недостаточно изучены их локализация, характер взаимодействия с опиатными рецепторами и функции in vivo. Не ясно также, существуют ли их аналоги с высокой избирательностью по отношению к δ- и к-рецепторам.

'''Молекулярные основы взаимодействия лигандов с опиатными рецепторами'''. Пептиды и небольшие небелковые молекулы могут по-разному связываться с рецепторами, сопряженными с G-белками. Как показали мутации генов адренорецепторов и дофаминовых рецепторов, большое значение для связывания лиганда и активации рецептора имеют заряженные аминокислоты в трансмембранных доменах (Strader et al., 1988; Mansour et al., 1992): лиганд связывается с сердцевиной рецептора, образуемой этими доменами. С другой стороны, решающую роль в распознавании лигандов пептидными рецепторами играют внеклеточные петли (Xie et al., 1990). Опиатные рецепторы сочетают эти свойства: с заряженными аминокислотами трансмембранных доменов связывают высокое сродство к большинству лигандов — как пептидов, так и алкалоидов (Surratt et al., 1994; Mansour et al., 1997); в то же время важную роль во взаимодействии с эндогенными опиоидами играют внеклеточные петли.

По-видимому, N-концевой опиоидный фрагмент Тир—Гли— Гли—Фен необходим для взаимодействия с рецептором, тогда как С-концевой фрагмент обеспечивает избирательность этого взаимодействия (Schwyzer, 1986). Длинный С-концевой фрагмент может связываться с внеклеточными петлями рецептора, и такая избирательность будет недостижима для небольших молекул алкалоидов. Так, избирательность динорфина А в отношении к-рецепторов зависит от второй внеклеточной петли (Kongetal., 1994;Xueetal., 1994; Mengetal., 1995); механизм избирательности лигандов δ- и μ-рецепторов более сложен и связан с несколькими внеклеточными петлями. Выдвинута гипотеза, что высокая избирательность обеспечивается как притяжением к рецепторам с высоким сродством, так и отталкиванием от рецепторов с низким сродством (Watson et al., 1995; Meng et al., 1995). Например, рецептор ORL1 не связывает энкефалины, эндорфины и динорфины, но при изменении лишь 4 аминокислот он приобретает сродство к динорфинам, сохраняя сродство к ноцицептину (Meng et al., 1996). Это говорит об особом механизме, который обеспечивает сродство ORL1 к ноцицептину, но препятствует связыванию с другими эндогенными опиоидами. Достаточно сложно разделить механизмы, создающие избирательность и высокое сродство, так как функция внеклеточных петель может заключаться не только в связывании пептида, но и в стабилизации возникшей связи.

Как показали упомянутые выше исследования, небольшой размер алкалоидов позволяет им полностью помещаться в сердцевине рецептора или рядом с ней, тогда как пептиды связываются с внеклеточными доменами и одновременно достигают сердцевины рецептора, чтобы активировать его. Эти различия хорошо видны на примере генноинженерного к-рецептора, который не реагирует с эндогенными опиоидами, сохраняя высокое сродство к синтетическим лигандам небольшого размера, например спирадолину (Coward et al., 1998). Соответственно, разные лиганды могут по-разному действовать на опиатные рецепторы, вызывая различные по характеру и продолжительности конформационные изменения с более или менее выраженной активацией вторых посредников, возможно, тоже различных. Если это так, то может появиться механизм более тонко вмешиваться во взаимодействия опиатных рецепторов с путями внутриклеточной передачи сигнала. Наряду с возможностью существования гетеродимеров опиатных рецепторов, придающих им новые свойства (Jordan and Devi, 1999), это создает ряд новых направлений для поиска препаратов, действующих на опиатные рецепторы в определенных состояниях.

== Внутриклеточная передача сигнала ==

=== Вторые посредники === 

Опиатные μ-, δ- и к-рецепторы сопряжены с G-белками, чувствительными к коклюшному токсину. Активация этих рецепторов приводит к ингибированию аденилатциклазы (Herz, 1993), открыванию ряда калиевых каналов и снижению тока через потенциалзависимые кальциевые каналы (Duggan and North, 1983). Гиперполяризация, вызванная повышением калиевого тока, с одной стороны, и подавление входа кальция — с другой, может уменьшать высвобождение медиаторов и тем самым блокировать проведение возбуждения в различных ноцицептивных путях. Впрочем, такое объяснение действия опиоидов хоть и логично, но пока не доказано. Согласно работам с использованием клонированных генов, опиатные рецепторы могут активировать и другие вторичные посредники, включая каскад митоген-активируемых протеинкиназ и фосфолипазу С, под действием которой образуются ИФ3 и ДАГ (Akil et al., 1997). Длительное действие опиоидов вызывает адаптивные изменения во многих звеньях систем вторых посредников. Эти изменения важны тем, что они могут служить молекулярным субстратом толерантности, сенсибилизации и абстинентного синдрома.

=== Механизмы толерантности === 

Толерантность — это снижение эффекта прежних доз препарата при его повторном применении. Обычно толерантность развивается при длительном приеме препаратов, хотя кратковременное использование наркотических анальгетиков вызывает феномен, который иногда называют острой толерантностью. Молекулярным механизмам этого феномена были посвящены несколько недавних работ. По-видимому, он обусловлен кратковременной десенситизацией μ- и δ-рецепторов, связанной с их фосфорилированием протеинкиназой С (Mestek et al., 1995; Narita et al., 1995; Ueda et al., 1995); обсуждается также роль протеинкиназы А и киназы β-адренорецепторов (см. ниже, а также Pei et al., 1995; Wang et al., 1994).

Как и другие рецепторы, сопряженные с G-белками, μ- и δ-рецепторы в присутствии стимуляторов быстро интернализуются путем эндоцитоза (Trapaidze et al., 1996; Gaudriault et al.,1997), но к-рецепторы остаются на мембране даже при длительном действии стимуляторов (Chu et al., 1997). Очевидно, механизмы эндоцитоза ® и δ-рецепторов несколько различаются и существуют специфичные для них механизмы внутриклеточного транспорта (Gaudriault et al., 1997). Интересно, что этот процесс может зависеть от структуры лиганда: некоторые стимуляторы (эторфин и энкефалины) вызывают быструю интернализацию μ-рецепторов, тогда как морфин в такой же степени снижает активность аденилатциклазы, но не ведет к интернализации (Keith et al., 1996). Укороченные μ-рецепторы, сохраняющие способность к взаимодействию с G-белками, циркулируют между мембраной и цитозолем (Segredo etal., 1997). Все эти данные согласуются с гипотезой, что разные лиганды ведут к разным конформационным изменениям рецепторов и внутриклеточным процессам, позволяя объяснить различия в эффективности наркотических анальгетиков и их способности вызывать зависимость. В одной из наиболее интересных работ, посвященных влиянию внутриклеточных процессов на эффекты опиоидов in vivo, было выявлено усиление обезболивающего действия морфина у мышей, лишенных β-аррестина 2 (Bohn et al., 1999). Интернализация опиатных рецепторов по крайней мере частично обусловлена киназами семейства GRK (гл. 6): они избирательно фосфорилируют рецептор, связанный со стимулятором, после чего к нему присоединяются β-аррестины, которые нарушают сопряжение с G-белками и вызывают интернализацию (Bohn et al., 1999). Усиление обезболивания у мышей, лишенных β-аррестина 2, подтверждает участие киназ семейства GRK и аррестинов в регуляции чувствительности к опиоидам in vivo. Это особенно любопытно, поскольку in vitro морфин не вызывает связывание опиатных рецепторов с аррестинами и их интернализацию (Whistler and von Zastrow, 1998).

Развитие «классической» толерантности (при длительном приеме препаратов) объясняют повышением активности аденилатциклазы, компенсирующим вызванное опиоидами падение внутриклеточной концентрации цАМФ (Sharma et al., 1977). Действительно, длительное применение стимуляторов μ-рецепторов сопровождается выраженным повышением активности аденилатциклазы (Avidor-Reiss et al., 1996). Это явление предотвращают коклюшный токсин и белки, связывающие комплекс субъединиц βу. Значит, в активации аденилатциклазы участвует комплекс βу белков Gj и G0. Колебания концентрации цАМФ ведут к многочисленным изменениям в системе вторых посредников (Nestler and Aghajanian, 1997).

== Особенности опиоидергической передачи ==

Кажущийся парадокс эндогенной опиоидной системы заключается в несоответствии значительного количества лигандов небольшому числу рецепторов, тогда как в других медиаторных системах один лиганд взаимодействует с несколькими рецепторами различного строения, имеющими разные вторые посредники. Утрачивается ли это разнообразие сигналов, когда многочисленные пептиды, берущие начало от разных генов, реагируют лишь с тремя рецепторами, или способы его сохранения просто не известны? Не исключено, что клонированы еще не все гены опиатных рецепторов. Другие объяснения включают альтернативный сплайсинг, посттрансляционные изменения и димеризацию рецепторов (см. выше). Но даже в этом случае связывание многих лигандов с тремя рецепторами — признак значительной конвергенции. Впрочем, такая конвергенция может быть лишь кажущейся, если учесть описанные выше механизмы разнообразия реакций опиатных рецепторов на разные лиганды. Обратим внимание и на следующие факторы:

*Длительность действия эндогенных опиоидов обычно не учитывается, хотя она может иметь решающее значение, в том числе и для их клинического применения.
*Эффект опиоидов может зависеть не от активации одного рецептора, а от характерного профиля активации нескольких рецепторов одним лигандом.
*Каждый ген белков-предшественников опиоидов может давать начало множеству пептидов с уникальными профилями активности; характер этой активности может быть очень сложным и регулироваться различными факторами.
*Изучаются внутриклеточные изменения, возникающие под действием эндогенных опиоидов (Emmerson et al., 1996). Эти процессы помогут понять физиологические сдвиги на фоне длительного введения опиоидов.
*Внутриклеточный транспорт рецепторов может зависеть как от рецептора, так и от лиганда. Это может иметь большое значение для долгосрочной адаптации к постоянному приему наркотических анальгетиков и их отмене.

Понимание физиологии эндогенной опиоидной системы позволит выявить сходства и различия между действием эндогенных опиоидов и наркотических анальгетиков. Это поможет максимально использовать полезные эффекты последних (прежде всего обезболивающий), сведя к минимуму такие нежелательные явления, как толерантность и зависимость.